PRÁCTICA 20: HYDRAGEL HB K20

 

PRÁCTICA 20: HYDRAGEL HB K20

Ø  Número de Procedimiento/técnica: 20

Ø  Denominación: Hydragel Hb K20

Ø  Nombre del técnic@ que lo realiza: Araceli Alejandra Rojas Arispe

Ø  Grupo de trabajo: Ainhoa Castro Larrauri y Araceli Alejandra Rojas Arispe

 Preparación de las muestras

• Centrifugue la sangre no coagulada a 5 000 r.p.m. durante  5 minutos.

• Deseche el plasma.

• Lave los glóbulos rojos 2 veces con 10 volúmenes de solución salina; tenga mucho cuidado al procesar volúmenes de glóbulos rojos inferiores a 10 ml.

• Hemolice 10 µl de glóbulos rojos empaquetados con 130 µl de Solución Hemolizante.

• Agite en el vórtex durante 10 segundos e incube durante 5 minutos a temperatura ambiente.

NOTAS :

·       El hemolizado no necesita ser filtrado o centrifugado.

·       La solución hemolizante de Sebia no afecta a la inestable hemoglobina de Bart.

Procedimiento

1.     Dispense 120 ml de agua destilada o desionizada en el tercio inferior del marco impreso en el soporte del aplicador K 20.

2.     Saque el gel de agarosa de su envoltorio y seque el exceso de tampón con un papel de filtro fino.

3.     Coloque el gel apoyando su base contra el tope situado en la base del marco impreso. Haga que el gel contacte con el agua, de forma que quede colocado en la base.

4.     Aplique las muestras: se aplican 10 ml de muestra hemolizada en cada pocillo.

Una vez se han aplicado las muestras hay que usar el aplicador sin demora.

Coloque el aplicador en la posición n º 4 del soporte del aplicador. Baje el soporte del aplicador para que el aplicador contacte con el gel, y déjelo en esta posición durante 1 minuto. Después de ese tiempo, gire la rueda giratoria para elevar el aplicador y deséchelo.

5.     Migración:

VOLTAJE: 165 V          TIEMPO: 15 minutos           CORRIENTE INICIAL (1 gel): 7 ± 2 mA.

6.     FIJACIÓN con aire caliente o con solución fijadora (unos 10 minutos), hasta que el gel esté seco; es necesario esperar a que se enfríe antes de teñirlo.

7.     TINCIÓN y DECOLORACIÓN.

a)     TINCIÓN con colorante durante 5 minutos.

b)    DECOLORACIÓN en 3 baños sucesivos de solución decolorante hasta que desaparezca la coloración de fondo.

c)     SECADO del gel con aire caliente.

8.     LECTURA: 

Lea el gel usando un densitómetro a 570 nm o con un filtro amarillo. Coloque la fracción A2 en la marca de 5 mm de la placa de lectura; el cero de lectura se realiza entre las fracciones de A2 y de anhidrasa .