PRÁCTICA 18: DETERMINACIÓN DEL Fe

 

PRÁCTICA 18: Determinación del Fe sérico y CFTH

Ø  Número de Procedimiento/técnica: 18

Ø  Denominación: Determinación del Fe  

Ø  Nombre del técnic@ que lo realiza: Araceli Alejandra Rojas Arispe

Ø  Grupo de trabajo: Ainhoa Castro Larrauri y Araceli Alejandra Rojas Arispe

 

1.     Fundamento

Se trata de un método colorimétrico de la casa Spinreact (se adjunta el protocolo) que utiliza como muestra PLASMA. Primero separa el hierro de la transferrina y a través del ácido ascórbico pasarlo a ión ferroso, que en presencia de Ferrozine forma un complejo coloreado cuya intensidad es proporcional a la concentración de hierro en la muestra.

El procedimiento que seguimos es primero el llenado de las cubetas (utilizar tubos después a cubetas) como se muestra en la tabla. A continuación se mezclan bien y se dejan incubar durante unos 10 minutos para por último medir su absorbancia en el espectrofotómetro. Para realizar los cálculos posteriores es importante saber que la concentración del patrón es de 100 µg/dl. 

La transferrina sérica se satura con un exceso de Fe³⁺ y el exceso no fijado se elimina por precipitación con carbonato magnésico (quelante), determinándose a continuación la cantidad total de hierro presente. La diferencia entre la capacidad de fijación total de hierro hallada (CFTH) y el hierro sérico inicial (Hb) nos da la capacidad de fijación de hierro no saturado o residual. 

2.     Material, aparataje y reactivos

• R1: Tampón Acetato pH 4,9             100mmol/L
• R2: Reductor Ácido ascórbico          99,7%
• R3: Color FerroZine                          40mmol/L
• Patrón                                                100 microg/L

Para preparar el reactivo de trabajo (RT), disolvemos el contenido de un tubo de R2  en el de R1. Lo tapamos y movemos suavemente, hasta disolver el contenido.

3.     Protocolo

Determinación del Fe:

Cubetas	Blanco RT	Patrón	Blanco Muestra	Muestra
RT (ml)	1,0	1,0	1,0	1,0
R3 (gotas)	1	1	---	1
Agua destilada (µl)	200	---	---	---
Patrón (µl)	---	200	---	------
Muestra (µl)	---		200	200

 

Determinación CFTH:

1. Pipetear en los tubos:

Muestra (mL)	0,5
R 5 Solución saturante (mL)	1,0

 

2. Mezclar bien e incubar 10 minutos a Temperatura ambiente (15-25ºC).

 

3. Añadir a cada tubo:

R 6 Agente precipitante (dosis)

3 (cucharadas que vienen en envase)

4. Mezclar bien e incubar 10 minutos a temperatura ambiente.

5. Centrifugar 15 min. a 3000 r.p.m.

6. Recoger el SOBRENADANTE, cuidadosamente y procesar como una muestra para la determinación de hierro. 

Ajustar el espectrofotómetro a cero frente a agua destilada. A 562 nm se hace la lectura.

1.     Resultados (y cálculos)

Determinación del Fe:

A (patrón) = 0'280

A (blanco muestra) = 0'159

A (muestra) = 0'306

A (Blanco RT) = 0'167

(A muestra- A blanco muestra)/  A patrón x 100 µg/dl

(0'306 - 0'159)/ 0'280 x 100 µg/dl = 52'5 µg/dl de Fe

Determinación de CFTH:

A (blanco muestra) = 0'08

A (muestra) = 0'086

(0'086 - 0'08) /0'280 x 100 = 2'14