PRÁCTICA 19: ESTUDIO DE LAS ANEMIAS
PRÁCTICA 19: ESTUDIO DE LAS ANEMIAS
Ø Número de Procedimiento/técnica: 19
Ø Denominación: Estudio de las anemias
Ø Nombre del técnic@ que lo realiza: Araceli Alejandra Rojas
Arispe
Ø Grupo de trabajo: Ainhoa Castro Larrauri y Araceli Alejandra Rojas
Arispe
1. Fundamento
1. Prueba de sacarosa
Consiste en situar los hematíes en un medio de baja fuerza iónica, por lo que tienden a fijar el complemento, teniendo los hematíes, frente a este, una sensibilidad anormalmente alta. En este medio, los hematíes tienden a fijar el complemento y aquellos que son especialmente sensibles se lisan con facilidad. Prueba útil en el diagnóstico de alteraciones en la membrana eritrocitaria.
2. Test de acidifiación del suero. Prueba de HAM -DACIE.
El complemento es una proteína plasmática que al activarse por el complejo Ag-Ac provoca la lisis celular. Esta acción lítica es favorecida por un descenso del pH del medio (6,5-7) o de la fuerza iónica.
En los hematíes normales, esta acción no aparece ni con el descenso del pH del medio. Solo sucede en la E-HPN (Hemoglobinuria Paroxística Nocturna), en la que aparece hemólisis significativa al acidificar el suero.
Consiste en ver si se produce hemólisis de los hematíes al ser incubados en presencia de suero propio o acidificado. Si realmente se produce se trata de una membranopatía en al que los hematíes presentan una sensibilidad a la acción lítica del complemento.
3. Autohemólisis
Los hematíes mantienen su integridad molecular gracias a su escaso contenido en ATP, que obtiene exclusivamente a través de la glucólisis. Si por un defecto congénito del metabolismo disminuye la capacidad glucolítica del hematíe, el descenso de ATP producirá un acortamiento de su vida media. Esta prueba tiene como finalidad poner de manifiesto la capacidad de los hematíes para mantener su integridad in Vitro después de un cierto tiempo de incubación.
2. Material, aparataje y reactivos
Solución isotónica de sacarosa (92,4 gr/L). Estable a 4º durante 21 días.
2. Test de acidifiación del suero. Prueba de HAM -DACIE.
Reactivos:
1º hematíes lavados
obtenidos de sangre y
2º suero del paciente y de un sujeto control
-
Solución
de glucosa estéril al 10%
- Sangre anticoagulada y/o desfibrinada
3. Protocolo
1. Prueba de sacarosa
Procedimiento
|
|
Tubo SF |
Tubo S. CONTROL |
Tubo S. PROBLEMA |
|
Suero fisiológico: SF |
1,8 ml |
|
|
|
Solución de sacarosa
(9,24 %) |
|
1,8 ml |
1,8 ml |
|
Sangre Control: SC |
|
0,2 |
|
|
Sangre Problema: SP |
0,2 |
|
0,2 |
%Hemólisis = Ab del tubo problema x 100/ Ab del tubo patrón (control)
Resultados
Los valores normales son : negativo menos del 5% y positivo más del 10%
2. Test de acidifiación del suero. Prueba de HAM -DACIE.
|
Tubos |
1 |
2ª |
3 (56ºC) |
4 |
5ª |
|
Suero del paciente |
0,5 |
0,5 |
- |
- |
- |
|
Suero normal |
- |
- |
0,5 |
0,5 |
0,5 |
|
Hematíes del paciente |
0,05 |
0,05 |
0,05 |
0,05 |
0,05 |
|
CLH 0,2 N |
- |
0,05 |
0,05 |
- |
0,05 |
Resultados
3. Autohemólisis
Se preparan:
|
Tubo |
Tubo 1 |
Tubo 2 |
Tubo 3 |
Tubo 4 |
|
Glucosa (ml) |
- |
- |
0,1 |
0,1 |
|
Sangre (ml) |
2 |
2 |
2 |
2 |
-
El
resto de sangre se centrifuga para obtener plasma (conservar a 4ºc) que se
usará como blanco.
-
Incubamos
a 37 º los tubos tapados, durante 48 h. (agitamos los tubos a las 24 h.)
-
Mezclamos
los tubos 1-2 y 3-4.
-
Obtenemos
el hematocrito de ambos tubos
-
Centrifugamos
el resto de sangre y con el SOBRENADANTE (PLASMA) preparamos:
|
Tubo
|
1 |
2 |
3 |
4 |
|
Sol.
NH4OH* al 0,04% (ml) |
4,9 |
4,9 |
4,9 |
4,9 |
|
Plasma
conservado a 4º |
0,1 |
|
|
|
|
Plasma
con glucosa (3-4) |
|
|
0,3 |
|
|
Plasma
sin glucosa (1-2) |
|
0,1 |
|
|
|
Sangre
total |
|
|
|
0,1 |
|
|
|
|
|
|
1.Leemos en el espectrofotómetro a 540nm y calculamos la hemolisis
Abs (tubo 2/3) x 100- VHto (2/3)
------------------
100
% de lisis: ------------------------------------------------------------------ x100
Abs tubo 4 x 20
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